«При большинстве событий у отечественной модели archaeon, Methanosarcina acetivorans, имеется удваивающееся время восьми – десяти часов, в случае если сравнивать с E. coli, что может удвоиться приблизительно через 30 мин.. То, что это показывает, – то, что выполнение генетики, получение мутанта, смогут занять месяцы – то же самое заняло бы три дня в E. coli», растолковывает Наяк. «Что CRISPR-Cas9 разрешает нам сделать на очень несложном уровне, ускоряют целый процесс. Это удаляет главное узкое место… в проведении изучения генетики с этим archaeon.
«Еще больше», продолжает Nayak, «с отечественными прошлыми методами, мутации должны были быть введены один движение за один раз. Используя эту новую разработку, мы можем ввести многократные мутации одновременно с этим. Мы можем расширить процесс поколения мутанта по экспоненте с CRISPR».
CRISPR, мелкий для Сгруппированных Мелких Палиндромных Повторений, в которых Систематично Делают промежутки, начался как свободная совокупность обороны в archaea и бактериях. Определяя и храня мелкие фрагменты зарубежной ДНК, Авария (CRISPR-связанная совокупность) белки в состоянии не так долго осталось ждать узнать, что ДНК в будущем, так, чтобы это имело возможность тогда не так долго осталось ждать быть стёрто с лица земли, защитив организм от вирусного вторжения.Начиная с ее открытия версия данной иммунной совокупности – CRISPR-Cas9 – была поменяна, чтобы отредактировать геномы в лаборатории.
Соединяя Cas9 с определенно спроектированным управлением РНК, а не фрагментом агрессивной ДНК, совокупность CRISPR вероятно предписана сократить геном клетки в произвольном месте, так, что существующие гены смогут быть удалены, или добавлены новые. Эта совокупность была в изобилии нужна в редактировании эукариотических совокупностей от дрожжей, к заводу, чтобы ловить рыбу и клетки человека, взяв для него Прорыв Американской ассоциации содействия формированию науки 2015 года премии года.
Но его внедрение в прокариотических разновидностях было встречено препятствиями, частично благодаря их различным клеточным процессам.Чтобы использовать CRISPR в клеточной совокупности, исследователи должны создать протокол, что принимает во внимание предпочтительный механизм клетки ремонта ДНК: по окончании того, как «молекулярные ножницы CRISPR» уменьшают хромосому, совокупность ремонта клетки вступает, чтобы исправить повреждение через механизм, что может употребляться, чтобы удалить или добавить дополнительный генетический материал. В эукариотических клетках это принимает форму Non-Homologous End Joining (NHEJ).
Без оглядки на то, что этот путь употреблялся для CRISPR-установленного редактирования, у него имеется тенденция ввести генетические неточности в течении ее процесса ремонта: нуклеотиды, ступени лестницы ДНК, частенько добавляются или удаляются на месте сокращения.NHEJ очень неординарен у прокариотов, включая Archaea; вместо этого, их ДНК чаще восстановлена при помощи процесса, известного как направленный на соответствие ремонт. Сравнивая повреждение шаблона ДНК, направленный на соответствие ремонт формирует то, что Наяк именует «детерминированным шаблоном» – конечный результат вероятно предсказан заблаговременно и скроен к верным потребностям исследователя.
Во многих отношениях направленный на соответствие ремонт в конечном итоге предпочтителен для редактирования генома: «Так, как мы хотим, чтобы CRISPR-Cas9 сделал направленным, редактирует в эукариотических совокупностях, мы частенько заканчиваем с вещами, каковые мы не хотим из-за NHEJ», растолковывает Наяк. «В этом отношении это была хорошая вещь, что у большинства напряжений archaeal нет несоответственного финиша, присоединяющегося к совокупности ремонта, так, единственный способ, которым вероятно восстановлена ДНК, через этот детерминированный соответственный маршрут ремонта».Без оглядки на то, что это может казаться парадоксальным, один из Наяка и первое использование Меткалфом CRISPR-Cas9 должны были ввести механизм NHEJ в Methanosarcina acetivorans.
Без оглядки на то, что как правило не предпочтительный для редактирования генома, говорит, что Наяк, у NHEJ имеется одно использование, для которого это превосходит соответственный ремонт: «Если Вы удалить ген, если Вы не заботитесь, как… несоответственное присоединение финиша в конечном итоге более действенно».При помощи введенной совокупности ремонта NHEJ, чтобы выступить то, что известно как изучения «нокаута», где единственный ген удален или должен замолчать, чтобы видеть, какие конкретно конкретно трансформации позваны и что обрабатывает тот ген, имело возможность бы затронуть, Наяк говорит, что будущее изучение будет в состоянии собрать генетический атлас M. acetivorans и других archaeal разновидностей. Такой атлас был бы поразительно нужен для множества областей вовлечения изучения Archaea, включая особенно занимательную область в лабораторию Меткалфа, изменение климата.
«Methanosarcina acetivorans – то из самый генетически послушных напряжений archaeal», говорит Наяк». [Methanogens] класс archaea, каковые создают гигатонны этого превосходного парникового газа каждый год, играют роль краеугольного камня в глобальном углеродном цикле, и исходя из этого значительно содействуют глобальному трансформации климата». Изучая генетику этого и подобных организмов, Наяк и Меткалф сохраняют веру забрать не только более глубокое познание archaeal генетики, но и их роли в более широких экологических процессах.
В целом, это изучение мнит увлекательное новое направление в изучении и управлении archaea. «Мы начали это изучение, чтобы узнать, было ли использование редактирования генома CRISPR-Cas9 в archaea помимо этого возможно», завершает Наяк. «Что мы нашли, то, что это не только возможно, но и это трудится превосходно замечательно, как раз в то время, в то время, когда в случае если сравнивать с эукариотическими совокупностями».