Когда клетки умирают, будь то в результате апоптоза или некроза, ДНК и другие молекулы, обнаруженные в этих клетках, просто не исчезают. Они попадают в кровоток, откуда могут быть извлечены разложившиеся осколки.
Эта внеклеточная ДНК (вкДНК) разлагается из-за воздействия ферментов в крови, но, тем не менее, является мощным инструментом мониторинга при раке, беременности и трансплантации органов. Одним из сравнительно недавних достижений является пренатальное тестирование на такие состояния, как синдром Дауна, поскольку фрагменты вкДНК плода могут быть обнаружены в кровотоке матери.
Теперь, заимствуя технику геномики, использовавшуюся при изучении древнего прошлого, аспирант Корнелла придумал диагностический инструмент, который может открыть окно в ближайшее будущее реципиента трансплантата посредством анализа вкДНК.
Филип Бернхэм, докторант лаборатории Ивийн де Вламинк, лаборатория Роберта Н. Доцент кафедры естественных наук и технологий Нойс предложил использовать препарат библиотеки коротких цепей ДНК для секвенирования вкДНК в плазме реципиентов трансплантата легких. Библиотека ДНК – это коллекция фрагментов ДНК, которые были клонированы в группы, чтобы исследователи могли выделить желаемые фрагменты для изучения.
Бумага лаборатории, "Подготовка библиотеки одноцепочечной ДНК раскрывает происхождение и разнообразие ультракороткой бесклеточной ДНК в плазме," был опубликован в Интернете 14 июня в журнале Nature Scientific Reports. Бернхэм, аспирант третьего курса факультета физики и биомедицинской инженерии, был ведущим автором первой опубликованной работы лаборатории.
Определение источника вкДНК – часть ее из митохондрий, производителя энергии в клетках – может помочь определить, поврежден ли трансплантированный орган или отторгается.
"Митохондриальные последовательности донора отличаются от митохондриальных последовательностей реципиента, поэтому, выполнив этот анализ последовательности, вы можете отличить их друг от друга," Де Вламинк сказал. "Когда клетки повреждены, они высвобождают митохондриальную ДНК, и, учитывая, что вы можете отличить ДНК донора от ДНК пациента, вы действительно можете количественно оценить повреждение, выполнив эти измерения."
В 2012 году немецкий антрополог Маттиас Мейер опубликовал статью об исследовании денисовцев – людей примерно 40 000 лет назад – и об использовании метода подготовки библиотеки одноцепочечной ДНК для секвенирования денисовского генома.
Нуклеосомная ДНК – ДНК, обнаруженная в клетках, – может быть адаптирована для секвенирования с использованием адаптеров двухцепочечной ДНК, но это не вариант для генетического материала возрастом 40000 лет. ДНК, собранная из старых костей, разрушается и образует короткие нити – так же, как и многие типы вкДНК.
"Поэтому Фил решил применить эти концепции к ДНК в крови," Де Вламинк сказал. "И когда он это сделал, мы обнаружили множество коротких молекул ДНК."
Группа взяла 40 образцов вкДНК из плазмы шести реципиентов двойного трансплантата легких и протестировала их с использованием как одноцепочечных, так и двухцепочечных препаратов библиотеки. Однонитевой метод оказался намного более эффективным, чем традиционный двухцепочечный метод при идентификации ультракороткой вкДНК (короче 100 пар оснований), что указывает на то, что он был бы лучше приспособлен для мониторинга плода и опухоли.
В идеале с помощью этого метода реципиент трансплантата может получить представление о реакции нового органа с помощью простого анализа крови. В настоящее время единственный способ узнать это – сделать биопсию – в некоторых случаях до 10 из них в течение первого года, – сказал Де Вламинк.
"Очевидно, вы могли бы позволить себе делать [анализ крови] чаще, и если он более чувствителен, есть надежда, что вы сможете вмешаться раньше, если возникнут проблемы," он сказал.
Группа надеется, что их методы приведут к более широкому использованию анализа вкДНК, и не только в случаях трансплантации.
"Прямо сейчас мы работаем в хорошей модельной системе – если мы видим донорскую ДНК у реципиента трансплантата легкого, то мы знаем, что она исходит из легкого," Бернхэм сказал. "Но то, что мы действительно настойчиво добиваемся, – это способность начать смотреть, из какой ткани поступает ДНК, без предварительного знания того, на что мы смотрим, и связывать это со способностью идентифицировать потенциальные патогены из микробной внДНК."
Этот метод также должен оказаться эффективным для выявления инфекций, которые беспокоят пациентов, перенесших трансплантацию. Иммунодепрессанты снижают риск отторжения органа, но делают пациента уязвимым для инфекции.