Биологи Калифорнийского технологического института провели первый крупномасштабный скрининг на позвоночных животных на наличие генов, регулирующих сон, и определили ген, гиперактивация которого вызывает тяжелую бессонницу. Экспрессия гена нейромедина U (Nmu) также, по-видимому, служит природным стимулятором – рыбам, лишенным этого гена, требуется больше времени, чтобы проснуться утром, и они менее активны в течение дня.
Вместо того, чтобы мутировать ДНК и проверять, какие функции были потеряны, исследователи использовали в новом исследовании подход, основанный на усилении функции. Сразу после оплодотворения, когда эмбрионы рыбок данио все еще были одиночными клетками, исследователи ввели им молекулу ДНК, называемую плазмидой, несущую ген, который был вставлен в геном некоторых клеток каждой рыбы. В частности, они хотели протестировать гены, которые, как предполагается, кодируют секретируемые белки, – такие, как нейропептиды, которые клетки производят, а затем высвобождают. Многие из генов, которые были идентифицированы как участвующие в сне, кодируют нейропептиды.
Используя генетический переключатель, называемый промотором теплового шока, который включается только тогда, когда рыба нагревается примерно до 37 градусов по Цельсию, биологи смогли контролировать, когда рыба экспрессирует каждый вставленный ген. Они держали переключатель включенным достаточно долго, чтобы рыбы сверхэкспрессировали каждый ген, создавая множество копий продуктов. Затем они использовали компьютеризированные видеомониторы для наблюдения за рыбками в течение нескольких дней, чтобы узнать, какие гены влияют на сон.
Затем исследователи создали трансгенных рыбок данио для каждого из генов, которые продемонстрировали сильное влияние на сон на генетическом экране. Этот трудоемкий подход дал им рыбок данио, у которых все клетки сверхэкспрессировали определенный ген в ответ на тепловой шок, что обеспечило более надежные результаты.
В конце концов, наиболее значительные изменения произошли в результате сверхэкспрессии Nmu, гена, который также встречается у млекопитающих и экспрессируется в части мозга, называемой гипоталамусом.
"После теплового шока рыбы с избыточной экспрессией Nmu гораздо более активны как днем, так и ночью," говорит Пробер. "Рыбы почти не спят всю ночь после теплового шока, поэтому у них проявляется очень серьезная форма бессонницы."
Когда исследователи мутировали рыбок данио так, чтобы у них не было Nmu, личинки были менее активны в течение дня. Взрослые рыбы без гена были особенно вялыми с утра.
Как и люди, рыбки данио обычно начинают просыпаться в конце ночи, а затем становятся намного более активными, когда включается свет. "Рыбы без Nmu ущербны в этом ожидании рассвета," говорит Пробер. "Таким образом, кажется, что этот ген особенно важен для перехода от ночного сна к дневному бодрствованию."
Чтобы изучить, как Nmu способствует бодрствованию, исследователи сначала исследовали роль гена в пути стрессовой реакции, известном как ось гипоталамус-гипофиз-надпочечники (HPA). Исследователи ранее показали, что Nmu участвует в возбуждении, вызванном стрессовыми ситуациями, и предположили, что он участвует в активации оси HPA. Однако Пробер и его коллеги обнаружили, что Nmu подавляет сон в той же степени у мутантов рыбок данио, лишенных белка, называемого глюкокортикоидным рецептором, который необходим для передачи сигналов оси HPA, как это было у рыб с функциональным рецептором глюкокортикоидов, предполагая, что ген действительно не действуют через ось HPA.
Затем исследователи вернулись к чертежной доске и спросили, какие нейроны в головном мозге активировались в результате сверхэкспрессии Nmu. Используя метод, который маркирует активированные нейроны, они наблюдали сильную активацию нескольких клеток, которые экспрессируют ген, называемый кортикотропин-рилизинг-гормоном (CRH), в стволе мозга.
"Это было удивительно, потому что CRH – это ген, который инициирует реакцию оси HPA, но клетки, которые это делают, находятся в гипоталамусе, другой части мозга, и они не активируются, когда мы сверхэкспрессируем Nmu," говорит Пробер. "Это еще одна популяция клеток CRH в стволе мозга, которые активируются сверхэкспрессией Nmu."
Исследователи обнаружили, что низкая доза препарата, блокирующего передачу сигналов CRH, полностью блокирует стимулирующий бодрствование эффект сверхэкспрессии Nmu у рыбок данио, тогда как более высокая доза также снижает бодрствование у нормальных рыб.
"Таким образом, передача сигналов CRH необходима не только для воздействия Nmu на поведение, но и для нормального уровня активности," объясняет Пробер.
Он отмечает, что было идентифицировано несколько генов и нейронов, способствующих бодрствованию или сну. Однако ученые до сих пор не знают, какие именно из них вызывают нарушения сна у людей. "Наше исследование предполагает, что Nmu может быть хорошим геном для изучения."