Для их изучений визуализации ученые использовали быстродействующую микроскопию ядерной силы (HS-AFM), метод для поверхностей отображения. Поверхность изучена, переместив мелкую консоль по нему; сила, испытанная изучением, вероятно преобразована в меру по высоте. Просмотр целой поверхности тогда ведет к карте высоты примера. Быстродействующая экспериментальная установка Shibata и сотрудников разрешила весьма не так долго осталось ждать, повторенные просмотры – конвертируемый в фильмы – принятия участия биомолекул в молекулярном действии разрезания ножницами.
Во-первых, ученые сравнили Cas9 без, и с РНК был характерен (Cas9-РНК). Они нашли, что первый смог гибко принять различный conformations, в то время как у последнего имеется фиксированная, структура с двумя лепестками, подчеркивая свойство конформационной стабилизации РНК управления Затем Shibata и сотрудники замечали на то, как устойчивый комплекс Cas9-РНК предназначается для ДНК. Они подтвердили, что это связывает с предварительно отобранным местом protospacer смежного мотива (PAM) в ДНК.
ПЭМ – маленькая последовательность нуклеотида, расположенная рядом с целевым местом ДНК, которое дополнительно к РНК управления.Быстродействующие фильмы исследовательской группы позже показали, что быть планированием (‘допрос ДНК’) достигнуто при помощи 3D распространения комплекса Cas9-РНК. Наконец, исследователям удалось визуализировать динамику самого процесса раскола: они подмечали, как область ‘молекулярных ножниц’ подвергается конформационным колебаниям по окончании того, как Cas9-РНК в местном масштабе раскручивает двухспиральную ДНК.
Работа достижений Shibata отечественное познание редактирующего геном механизма CRISPR-Cas9. В словах исследователей:»… это изучение предоставляет беспрецедентную подробную информацию о функциональной динамике CRISPR-Cas9 и подчеркивает потенциал HS-AFM, чтобы растолковать механизмы действия управляемых РНК нуклеаз аккуратного элемента от хороших совокупностей CRISPR-аварии."CRISPR-Cas9
CRISPR, мелкий для «сгруппированных мелких палиндромных повторений, в которых систематично делают промежутки», относится к последовательности бактериальных последовательностей ДНК, содержащих фрагменты ДНК вирусов, ранее нападавших на бактерии. Эти фрагменты употребляются бактериями, чтобы не допустить грядущие нападения тех же самых вирусов. «Авария» относится к CRISPR-связанным генам; «Cas9» – CRISPR-связанный белок с двумя областями нуклеазы (Нуклеаза – фермент, способный к расколу нуклеиновых кислот, органические молекулы, существующие в ДНК и РНК).на данный момент метод генной инженерии, где комплекс CRISPR-Cas9 действует как ‘молекулярные ножницы’, был развит; нуклеаза Cas9 связывает с молекулой РНК управления, которая содержит информацию о месте ДНК, чтобы предназначаться. Используя быстродействующую ядерную микроскопию силы, Mikihiro Shibata из Университета Канадзавы и сотрудников на данный момент изучили динамику комплекса CRISPR-Cas9 в маленьких подробностях.
Ядерная микроскопия силыАтомная микроскопия силы (AFM) – метод отображения, в котором изображение организовано, просмотрев поверхность с очень небольшим наконечником. Горизонтальным перемещением просмотра наконечника руководят через пьезоэлектрические элементы, в то время как вертикальное перемещение преобразовано в профиль высоты, приводящий к распределению высоты поверхности примера. Вследствие того что техника не включает линзы, ее ответ не ограничено так называемым пределом дифракции.
В быстродействующей установке AFM может употребляться, чтобы создать фильмы эволюции примера в настоящем времени. Быстродействующий AFM употреблялся удачно, чтобы изучить динамику белка, к примеру миозин V ходьбы на нити актина, фотовызванном конформационном изменении и ухудшении целлюлозы бактериородопсина.
Shibata и коллеги на данный момент применили быстродействующую технику AFM для визуализации динамики раскола ДНК CRISPR-Cas9.